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| 杂交瘤细胞系如何建立​‍

时间 11/2/2023 9:31:41 AM

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作者 博奥龙(Biodragon)


      杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique),顾名思义其主要用于制备单克隆抗体。杂交瘤细胞系的建立主要由三个关键步骤组成,分别为动物免疫,细胞融合,杂交瘤筛选。
 
  杂交瘤细胞是具有分泌特异性抗体的B淋巴细胞与具有增殖能力的骨髓瘤细胞融合,通过无性繁殖形成的细胞系。因此首先需要获得两个亲本细胞,这是建立杂交瘤细胞系的前提。
 
  动物免疫获得免疫B淋巴细胞
 
  要获得能够分泌特异性抗体的B淋巴细胞就需要用抗原对动物进行免疫。
 
  抗原:制备抗体的抗原在种类上几乎没有限制,具有抗原性质的物质都可以制备单克隆抗体。在免疫动物的过程中,我们常常将抗原分为2种类型:可溶性抗原如蛋白质,核酸等;颗粒性抗原如病毒,细菌,细胞等。一般颗粒性抗原都具有较强的免疫原性,可以不加佐剂,而可溶性蛋白抗原在免疫时需要添加佐剂,以获得良好的免疫效果。
 
  动物免疫
 
  (1)动物的选择目前常用的免疫动物为来自BALB/c小鼠和Lou大鼠以制备小鼠单克隆抗体和大鼠单克隆抗体。
 
  (2)免疫方法:常用的免疫方法有以下三种
 
  体内免疫法:通常指皮下,肌肉及腹腔免疫,多适用于各种颗粒性抗原和可溶性抗原。一般颗粒性抗原细胞的用量为2×107,且不需要加佐剂;可溶性抗原用量一般情况下不超过100µL,并需要加适宜的免疫佐剂。
 
  体外免疫法:从脾脏或者外周血分离B淋巴细胞在体外与抗原共同培养。此方法多用于制备单克隆抗体,如乙肝疫苗基础免疫后,取人外周血分离B淋巴细胞与乙肝表面抗原共同培养,制备人抗乙肝单抗。
 
  脾内免疫法:借助外科手术暴露动物的脾脏,将抗原直接注入脾脏。此方法一般需抗原量少,适用于一些来源有限且昂贵的抗原免疫。
 
  (3)免疫过程:
 
  可溶性抗原加佐剂后,皮下多点注射,至少三点以上,基础免疫一般4-6周,同剂量抗原加强免疫后,于融合前3-4天,静脉加强。
 
  颗粒性抗原基础免疫2-3周,间隔一周加强免疫,2-3次,于融合前3-4天用相应抗原静脉加强后取脾B淋巴细胞用于融合。

 
  骨髓瘤细胞的选择
 
  要取得良好的细胞融合效果,所用的杂交瘤细胞必须处于良好的生理状态,处于对数生长期的瘤细胞最佳。细胞数低于104/mL时,细胞生长缓慢,一般在104-5×105/mL时呈对数生长,此时细胞浑圆透亮,大小均一,排列整齐。当细胞密度超过106/mL以上时,细胞停止分裂,细胞发暗,皱缩。因此一般细胞传代选择(1-5)×105/mL的浓度,且融合时活细胞数至少应该大于90%。
 
  一株好的骨髓瘤细胞株应该具备以下几个特点:1)稳定,易培养;2)自身不分泌免疫球蛋白;3)融合率高;4)属于HGPRT缺陷株,便于HAT培养基筛选杂交瘤细胞。
 
  常见的骨髓瘤亲本细胞
 
  细胞融合
 
  在获得两个亲本细胞以后需要对其融合,以获得B淋巴细胞-骨髓瘤细胞杂合体。细胞融合是指在自然或者人工条件下使得两个或两个以上细胞合并为一个细胞的过程。虽然细胞在体外培养条件下可能会自发融合,但是概率极低,因此需要借助外界诱导方法促进细胞融合。
 
  诱导细胞融合的方法有生物法,化学法和物理法。
 
  生物法:如紫外灭火的仙台病毒诱导细胞融合,其可以大大提高融合概率,在病毒类融合剂中最为有效,适用广泛。
 
  化学法:目前应用广泛的有聚乙二醇。其易得,简便,融合效果也稳定。
 
  物理法:电融合
 
  杂交瘤细胞筛选
 
  1)杂交瘤细胞选择
 
  细胞融合会产生三种融合细胞:B淋巴细胞与B淋巴细胞融合体,骨髓瘤与骨髓瘤细胞融合体,第三种就是需要筛选出来的B淋巴细胞与骨髓瘤的杂合体。
 
  采用HAT培养基培养杂交瘤细胞,在该培养基中只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂合体才能存活并无限增殖。为此,在接种96孔板培养时,加入一定量的HAT培养液,经过1-2周的培养,杂交瘤细胞被选择培养出来。
 
  2)特异性抗体筛选
 
  初步筛选出来的杂交瘤细胞并不一定都能分泌特异性抗体,因此还需要进一步对这些杂合体进行筛选。目前实验室常用的是酶联免疫法,也就是将抗原固相在微孔板上,细胞培养上清一定时间后,用酶标记的抗鼠二抗,通过酶促底物的颜色变化了解是否存在针对该抗原的特异性抗体。该方法简便易行且可大规模操作,所以目前实验室都广泛采用此方法。
 
 
  杂交瘤细胞克隆建株
 
  在细胞融合初期,杂交瘤细胞的染色体常有丢失的现象,甚至导致其丧失分泌特异性抗体的功能。因此,在筛选抗体阳性的杂交瘤细胞时,应尽早进行克隆化,以保持杂交瘤细胞具有同源的子代。常见的方法有很多,比如有限稀释法(limiting dilution method)、软琼脂法(soft agar method)、单细胞显微操作法(single cell micromanipulation method)和荧光激活细胞分类仪(fluorescence activated cell sorter)。
 
  杂交瘤细胞一经建立应尽快冻存,保证杂交瘤细胞不会被污染或变异。因此,必须在得到分泌特异性抗体的杂交瘤细胞后的早期,保存几批细胞于液氮中,以便在发生意外时可以将其复苏,继续进行实验。