杂交瘤细胞筛选培养基怎么选择比较好​‍

      在单克隆抗体制备过程中，有两次的筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（选择性培养基）；第二次是进一步筛选产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
 
　　利用杂交瘤及时制备单克隆抗体的基本原理是根据以下三个原则：
 
　　1一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体；
 
　　2细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲本细胞的特性；
 
　　3利用代谢曲线补救机制筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆，然后增殖，制备所需的单抗。
 
　　细胞有正常和替代两条核苷酸合成途径，在组织培养中的细胞可利用二者之一，但一般情况下使用正常途径，只有在正常途径被抑制以后再启用替代途径。在哺乳动物细胞中，核苷酸合成替代途径的主要酶为次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶（HPRT），其催化嘌呤碱基同磷酸核糖焦磷酸盐（PRPP）缩合成嘌呤单磷酸核苷酸。
 
　　黄嘌呤-磷酸核糖转移酶催化嘌呤碱基同磷酸核糖焦磷酸盐
 
　　1,HPRT变异株培养筛选
 
　　HPRT基因变异株可在含有如8-氮鸟嘌呤（8-GA）一类的嘌呤类似物的培养液中被选择出来。HPRT能识别8-GA作为底物并且将其变为单磷核苷酸。含有8-AG的核苷酸进一步被加工后掺入到DNA和RNA中，而且有毒性。所以有HPRT酶作用的细胞在8-AG培养液中会死亡，即含有HPRT基因的细胞在该培养液中不能生存。然而，由于HPRT酶是非必需途径的一部分，HPRT基因变异株仍可生长良好。由于HPRT基因位于X染色体上，其正常突变率高到10-7，所以不需要加入诱变剂，直接使用8-AG处理，108或者更多的细胞即可筛选出HPRT变异细胞株。
 
　　2，HPRT变异株检测
 
　　HPRT缺失的细胞株可用抑制其正常合成核苷酸的途径的药物来检测。在这种环境中，细胞只能依赖其替代途径合成核苷酸，而HPRT变异株将不能利用替代途径而死亡。
 
　　有几种药物都可阻断细胞的正常的核苷酸合成途径。在杂交瘤细胞中使用较为常见的是重氮丝氨酸（Axaserine），氨基喋呤（Aminopiterin）和氨甲喋呤（Methotrexate）三种。培养基中加入叠氮丝氨酸，氨甲喋呤和氨基喋呤，将阻断正常嘌呤合成途径，促使细胞通过替代途径合成嘌呤核苷酸。用叠氮丝氨酸时阻断了嘌呤合成，一般加入次黄嘌呤（H），配成AH选择培养基；当用氨甲喋呤和氨基蝶呤时，嘌呤和嘌呤嘧啶合成途径被阻断，应补充次黄嘌呤和胸腺嘧啶，如HMT培养基和HAT选择培养基。
 
　　用于融合的骨髓瘤细胞由于是HPRT缺乏株，所以不能利用替代途径合成核苷酸而在选择培养基中死亡，而杂合细胞由于具有亲本细胞的遗传特性，可以在培养基中长期存活与繁殖。
 
　　3，选择培养基筛选
 
　　在用选择培养基如HAT选择培养1-2天内，将有大量骨髓瘤细胞死亡，3-4天后骨髓瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7-10天后应换HT培养液，之后改用普通培养液。在上述培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/5面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2-3天更换一半培养液。