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北京博奥龙:抗体亚型鉴定的原理及实验步骤​‍
时间:2019-06-28    浏览:   【 打印此页】  【 关闭


不同亚型的抗体在结构上有所区别,其免疫源性与在体内发挥的作用存在差异,对抗体进行进一步的细分,并进行抗体亚型鉴定,对于疾病作用机理的研究、抗体药物的开发有重要意义。那么什么是抗体亚型鉴定?众所周知,亚型指的是相同的构成方式,但是空间结构不同的蛋白质结构。抗体亚型,指的是在机体内产生的“Y”构型的免疫球蛋白(Ig),基于小分子多肽结构上的差异,可以进一步的进行细分。相关抗体亚型鉴定有:IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgM,IgA 的鉴定。
 

 抗体亚型鉴定
 

抗体亚型鉴定原理:

 

抗体亚型鉴定的原理是利用双抗体夹心法鉴定小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体或特异亲和纯化的单克隆抗体的类和亚类(可区分出 IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA)。采用小鼠抗体共有位点的二抗包被微孔板,与加入的培养上清中的小鼠抗体结合,再加入HRP 标记的抗小鼠各类、亚类的抗体来分别反应,最后用 TMB 底物系统显色并用稀硫酸终止,再通过酶标仪检测吸光度来判断被测单克隆抗体的类或亚类。

 

实验步骤:

 

1 、首先将ELISA试剂盒恢复室温(大约30分),然后用纯水把清洗液配成工作浓度(1份浓缩清洗液加19份纯水)。

 

2 、取出酶标板。每个标本需要6孔,阳性对照6孔,阴性对照6孔。多余的用自封袋保存,记得放入干燥剂。

 

3 、将标本检测孔每孔先加入标本稀释液各50μl。然后将50μl 细胞培养上清(或特异亲和纯化的抗体)再加入酶标微孔板,每个标本加6孔;阳性对照和阴性对照孔不加标本稀释液也是各加6孔每孔100μl。贴上封板膜37℃温育30分钟。

 

4 、弃去板内液体,洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。再在每个标本的6孔中分别加入6种酶标二抗各100μl,通用阳性、阴性对照的各孔也一样。在加样图上或酶标板上做好标记。贴上封板膜37℃温育30分钟。

 

5 、吸弃板内液体,洗板5遍后在不掉纤维的吸水材料上拍干或机洗5遍。每孔分别加入显色剂 A 和显色剂 B 各50μl,换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟。

 

6 、ELISA试剂盒特异性好一般肉眼即可观察出结果,看显色蓝的那个孔所对应的酶标二抗就知道此标本的 Ig 类或亚类。更可将反应终止液(每孔50μl)终止反应后用酶标仪450nm 测长,630nm 参考波长双波长测定结果,参看高值孔所对应的酶标二抗就知道此标本的 Ig 类或亚类(阳性对照 OD 一般不小于0.8,阴性对照一般不高于0.15,阳性判定标准:样品 OD 大于阴性 OD+0.15,阴性 OD 低于0.05按0.05算)。

 

注意事项:

 

1、虽然本试剂盒过期后很久还有使用价值但还是请您在有效期内使用。

 

2、在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万,虽然可以分辨但并不建议您这样做。此类样品成分十分复杂,有干扰结果的可能。在此种情况下您可以选择本公司的 BF06004小鼠单抗 Ig 类/亚类鉴定用酶标二抗套装。它会给您带来满意的结果,同时您也可以使用抗原包被板来解决此类问题。

 

3、手洗板子时一定要把孔加满,停留10秒然后弃尽,最后要拍干净。特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出,要吸净。这个在手工洗板时对结果很重要。

 

4、一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好,随盒存放。

 

5、拿放板子时不要剧烈抖动,以免孔间交叉污染出现错误结果。

 

6、本试剂一般不会出现两个阳性,但出现两个阳性的现象不论在进口或国产试剂中都是真实存在的,一般会一个 OD 很高,另一个很低但却还能判为阳性,实验分析表明这种情况下以 OD 高值孔为准,出现这种情况有多重原因:1、培养的细胞中有饲养细胞残留,2、抗体本身存在变异, 3、样品为非特异亲和纯化的抗体或样品是腹水,4、上清出现少量污染,5、实验操作粗放,6、加错试剂。

 

7、通用阳性对照数据并不一定完全一样,仅作为试剂有效指示。


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