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杂交瘤细胞筛选培养基怎么选择比较好​‍

时间 11/2/2023 9:32:18 AM

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作者 博奥龙(Biodragon)

      在单克隆抗体制备过程中,有两次的筛选过程,第一次是选出杂交瘤细胞(选择性培养基);第二次是进一步筛选产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
 
  利用杂交瘤及时制备单克隆抗体的基本原理是根据以下三个原则:
 
  1一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体;
 
  2细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲本细胞的特性;
 
  3利用代谢曲线补救机制筛选出杂交瘤细胞,并进行克隆,然后增殖,制备所需的单抗。
 
  细胞有正常和替代两条核苷酸合成途径,在组织培养中的细胞可利用二者之一,但一般情况下使用正常途径,只有在正常途径被抑制以后再启用替代途径。在哺乳动物细胞中,核苷酸合成替代途径的主要酶为次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶(HPRT),其催化嘌呤碱基同磷酸核糖焦磷酸盐(PRPP)缩合成嘌呤单磷酸核苷酸。
 
  黄嘌呤-磷酸核糖转移酶催化嘌呤碱基同磷酸核糖焦磷酸盐
 
  1,HPRT变异株培养筛选
 
  HPRT基因变异株可在含有如8-氮鸟嘌呤(8-GA)一类的嘌呤类似物的培养液中被选择出来。HPRT能识别8-GA作为底物并且将其变为单磷核苷酸。含有8-AG的核苷酸进一步被加工后掺入到DNA和RNA中,而且有毒性。所以有HPRT酶作用的细胞在8-AG培养液中会死亡,即含有HPRT基因的细胞在该培养液中不能生存。然而,由于HPRT酶是非必需途径的一部分,HPRT基因变异株仍可生长良好。由于HPRT基因位于X染色体上,其正常突变率高到10-7,所以不需要加入诱变剂,直接使用8-AG处理,108或者更多的细胞即可筛选出HPRT变异细胞株。
 
  2,HPRT变异株检测
 
  HPRT缺失的细胞株可用抑制其正常合成核苷酸的途径的药物来检测。在这种环境中,细胞只能依赖其替代途径合成核苷酸,而HPRT变异株将不能利用替代途径而死亡。
 
  有几种药物都可阻断细胞的正常的核苷酸合成途径。在杂交瘤细胞中使用较为常见的是重氮丝氨酸(Axaserine),氨基喋呤(Aminopiterin)和氨甲喋呤(Methotrexate)三种。培养基中加入叠氮丝氨酸,氨甲喋呤和氨基喋呤,将阻断正常嘌呤合成途径,促使细胞通过替代途径合成嘌呤核苷酸。用叠氮丝氨酸时阻断了嘌呤合成,一般加入次黄嘌呤(H),配成AH选择培养基;当用氨甲喋呤和氨基蝶呤时,嘌呤和嘌呤嘧啶合成途径被阻断,应补充次黄嘌呤和胸腺嘧啶,如HMT培养基和HAT选择培养基。
 
  用于融合的骨髓瘤细胞由于是HPRT缺乏株,所以不能利用替代途径合成核苷酸而在选择培养基中死亡,而杂合细胞由于具有亲本细胞的遗传特性,可以在培养基中长期存活与繁殖。
 
  3,选择培养基筛选
 
  在用选择培养基如HAT选择培养1-2天内,将有大量骨髓瘤细胞死亡,3-4天后骨髓瘤细胞消失,杂交细胞形成小集落,HAT选择培养液维持7-10天后应换HT培养液,之后改用普通培养液。在上述培养期间,杂交瘤细胞布满孔底1/5面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间,一般每2-3天更换一半培养液。

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