产品基本信息

• 产品货号 BDAA0197
• 产品名称 Recombinant Flag-Tag Monoclonal Antibody(3O2), HRP Conjugated
• 类别 抗体产品
• 推荐应用 WB,ELISA
• 反应种属 Species independent
• 存储缓冲液 1×PBS (pH7.4) ，0.05% proclin300，50% 甘油
• 稀释度 WB 1:30000-1:100000, ELISA 1:5000-1:10000
• 运输及保存条件 -20℃可保存2年，避免反复冻融
• 宿主 Human Recombinant
• 偶联物 辣根过氧化物酶 (HRP)
• 注意事项 1) 本产品为 HRP 直标抗体，需要避光保存于 -20℃或者 -80℃中； 2) 本产品灵敏度高，WB 稀释比值请按照说明书进行，否则可能会出现非特异性条带； 3) NC 膜或者 PVDF 膜在转膜前需要用甲醇激活，转膜后抗体稀释液尽量过量，转膜和抗体孵育过程中不要产生气泡； 4) 本品在 37℃下孵育 30min-60min 即可产生很明显的信号，常温孵育可适当延长时间。
• 背景介绍 DYKDDDDK 肽段是融合蛋白表达纯化过程中最常用的标签（tag）之一，DYKDDDDK 肽段也经常被称为 Flag 肽段 , 是 Sigma 公司的注册商 标。它可以连接在融合蛋白的 N 端、C 端或序列中间，具有极好的亲水性，更容易展示在融合蛋白的表面，干扰融合蛋白功能的可能性较小。这 一标签还具有一个优势：连接在目的蛋白 N 端时， 可以被 Enterokinase (EK protease) 从序列 C 端赖氨酸的位置切除， 而不留下冗余残基。 抗 DYKDDDDK 标签的抗体能对 DYKDDDDK 标签融合蛋白进行准确的检测和纯化，通过一定的工艺将辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联至 DYKDDDDK 标签抗体上， 进行 WB 实验时加入发光液 A 和 B，一般是鲁米诺和过氧化氢， 在辣根过氧化物酶 (HRP) 的催化作用下， 鲁米诺与 过氧化氢反应生成一种过氧化物， 过氧化物不稳定随即分解， 形成一种能发光的电子激发中间体， 当后者由激发态返回至基态， 就会产生荧 光，实现对 DYKDDDDDK 标签融合蛋白实现快速检测。
• 纯化 重组抗体，rProtein A 亲和纯化

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1) 表达系统：293 细胞分泌表达 ; 2) 蛋白信息：带有 DYKDDDDDK 标签的重组蛋白，大小≈25KDa； 3) 样本制备：还原Loading Buffer，100℃煮10min，新鲜制备； 4)上样顺序：1 为 10ng 纯化后的目的蛋白，2 为 50ng 纯化后的目的蛋白，3 为牛血清白蛋白 (BSA)； 5) 封闭：5%的脱脂奶粉(1XPBST进行溶解)；37℃封闭 1h； 6) 洗涤：1XPBST 摇床 80rpm 清洗 10min。重复清洗3次； 7) 抗体孵育： 10ml用 5%的脱脂奶粉稀释的HRP 直标抗体，37℃摇晃孵育 30min； 8) 显色： 洗涤后，ECL 进行显色； 9) 结论：Recombinant Flag-Tag Monoclonal Antibody(3O2), HRP Conjugated 按照 1：10000， 1：30000 和 1：100000 稀释后（抗体稀释体积 10ml）37℃摇晃孵育 30min， 能 够看到很明显的信号， 目的条带位置在 25KDa，在 50-55KDa 处有较弱的聚体条带， 随着稀释比值的增大， 信号值会有下降， 我们推荐客户使 用 1:30000 的梯度进行抗体稀释。

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