1.产品介绍
本产品可用于任何表达系统包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中纯化Strep II 和 Twin Strep-tag II 蛋白。Strep II标签是一个由8个氨基酸（Trp-Ser-His-Pro-Gln- Phe-Glu-Lys）构成的短序列，对重组蛋白的影响可以忽略不计，因此无需从重组蛋白上去除。进一步改进的 Twin Strep-tag II 是一个顺序排列的两个 Strep-tag II 序列（通过内部氨基酸连接），该标签能够像 Strep-tag II 一样进行温和、快速的纯化。Streptactin 是最稳定的蛋白之一，其偶联至高度交联的 4%琼脂糖微球上，使得融合蛋白在生理条件下亲和纯化，保证了蛋白质的生物活性。具体性能见表1。本产品具有较高的耐受性，可以多次使用。（表2）
表1. Streptactin层析介质（4FF）性能

性能	指标
基质	高度交联的4%琼脂糖微球
配体	Streptactin
载量	3-5 mg Twin Strep-tag II蛋白/ml介质
粒径 (μm)	45-165
最大流速	300cm/h
储存缓冲液	含20% 乙醇的1×PBS
储存温度	2-8°C

表2. Streptactin层析介质（4FF）耐受性

试剂	浓度
Reduction Agents
DTT	50 mM
β-mercaptoethanol	50 mM
Non-Ionic Detergents
C8E4 Octyltetraoxyethylene	最高0.88 %
C10E5; Decylpentaoxyethylene	0.12 %
C10 E6	0.03 %
C12 E8	0.005 %
C12E9; Dodecyl nonaoxyethylene (Thesit)	0.023 %
DM; Decyl-β-D-maltoside	0.35 %
LM; N-dodecyl β-D-maltoside	0.007 %
NG; N-nonyl-β-D-glucopyranoside	0.2 %
OG; N-octyl-β-D-glucopyranoside	2.34 %
TX; Triton X-100	2 %
Tween 20	2 %
Ionic Detergents
N-lauryl-sarcosine	2 %
8-HESO;N-octyl-2-hydroxy-ethylsulfoxide	1,32 %
SDS; Sodium-N-dodecyl sulfate	0.1 %
Zwitter-Ionic Detergents
CHAPS	0.1 %
DDAO; N-decyl-N,N-dimethylamine-N-oxide	0.034 %
LDAO; N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide	0.13 %
其它
Ammonium sulfate (NH4)2SO4	2 M
CaCl2	最高1 M
Ethanol	10%
EDTA	50 mM
Guanidine	最高1 M
Glycerol	最高25 %
Imidazole	最高250 mM
MgCl2	1 M
NaCl	5 M
Urea	最高1 M

2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
-结合/ 洗杂Buffer: 100mM Tris-HCl, 150mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0
（或PBS: 20 mM sodium phosphate ，280 mM NaCl ，6 mM potassium chloride ，pH7.4）
-洗脱Buffer: 结合Buffer中加入2.5mM脱硫生物素或 D-生物素
-再生Buffer：1M NaOH或 结合Buffer中加入1mM HABA
2.2  样品准备
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.3 层析介质装填
2.3.1 重力柱的装填
1.取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。
2.将层析介质混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。
3.加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。
4.装入润洗后的上垫片，确保垫片与层析介质之前没有空隙，且保持水平。
5.装填好的重力柱可以直接加入平衡液（结合buffer）进行平衡。暂不使用时则加入保护液，2-8℃保存。
2.3.2 中压层析柱的装填
Streptactin层析介质（4FF）被广泛用于工业纯化，因此，涉及到各种中低压色谱层析柱的装填，下面介绍填装层析介质的方法。
装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下：
V=1.15πr²h
V: 所需介质体积 ml
1.15: 压缩系数
r: 柱管半径 cm
h: 装填高度 cm
注意：所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。
1.用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2.将层析介质悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3.如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4.打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液 压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。(注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%)当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
5.关闭泵，关闭层析柱出口。
6.如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7.将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8.将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。
2.4  样品纯化
2.4.1 孵育法纯化
1.根据纯化的样品量，取适量Streptactin层析介质（4FF）加入离心管中，1000rpm离心1min，吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。
2.向离心管中加入5倍介质体积的平衡液（结合buffer）清洗介质，1000 rpm离心1 min，吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。
3.加入样品，封闭离心管或重力柱管，4 ℃振荡孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。
4.孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。
5.用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。
6.加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育5min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。
2.4.2 重力柱法纯化
1. 将装填好的重力柱用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，使层析介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。重复2-3次。
2. 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
3. 用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4. 使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。
2.4.3中压层析柱法纯化
中压层析柱装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。
1.将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
2.用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
3.使用至少5倍柱床体积的平衡液（结合buffer）平衡色谱柱。
4.利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5.用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。
6.使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积1/10的中和液进行中和。
注:上述步骤介质洗脱结束后，先用平衡液冲洗5-10倍柱体积，然后用纯水冲洗5-10倍柱体积，再用20%乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8℃保存。

2.5  SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
3.  层析介质清洗和再生
再生：
洗脱液为脱硫生物素时，用 5 倍柱体积（CV）的去离子水清洗，用 15 倍柱体积的含 1 mM HABA 的平衡液再生，然后用 30 倍柱体积的平衡液清洗。脱硫生物素被黄色溶液 HABA 取代，后者一旦与 Streptactin 复合即变为红色。HABA 随后被平衡液除去，柱子可被重新使用。
洗脱液为 D-生物素时 ，用 5 倍柱体积（CV） 的去离子水清洗 ，用 15 倍柱体积的 1 M NaOH 再生 ，然后用 30 倍柱体积的平衡液清洗。
保存：
层析介质再生清洗后保存在等体积的保护液（含20% 乙醇的1×PBS）中，置于2-8°C保存，防止层析介质被细菌污染。