1. 产品介绍
内毒素去除层析介质是一种用于去除生物源蛋白类产品（包括多肽、抗体、多糖等）中内毒素的产品。它是将修饰过的多粘菌素B连接至4%琼脂糖微球上，特异性去除内毒素，可将样品中内毒素降低至0.1EU/ml，样品回收率高。具体性能见表1。
表1. Endotoxin Removal Beads产品性能
| 性能 |
指标 |
| 基质 |
4%琼脂糖微球 |
| 配体 |
修饰过的多粘菌素B |
| 载量 |
>2,000,000EU/ml 介质 |
| 粒径 (μm) |
45-165 |
| 最大流速 |
0.1 MPa, 1 bar |
| pH 稳定范围 |
5-10 |
| 可耐受试剂 |
20%DMSO,20%乙醇,20%甘油；1M尿素,300mM咪唑；0.05% Tween 20, 10mM DTT等 |
| 储存缓冲液 |
20% 乙醇 |
| 储存温度 |
2-8℃ |
2. 内毒素去除流程
2.1 Buffer的准备
所有用水和及耗材均需无热源产品，防止在使用过程中引入内毒素。
平衡液: 20mM 磷酸盐，0.15M NaCl，pH7.4
再生液：1% Triton X-114
注: 平衡液和洗脱液可根据样品性质进行改变，建议pH7-8，NaCl约0.15M-0.5M。
2.2 样品准备
1.样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
2.样品PH最好控制在pH7-8，因为内毒素结合至柱子上的最佳pH为6-9。
3.样品最好控制适当的离子强度，减少非特异性吸附，如0.15-0.5M的NaCl。
2.3 内毒素去除
1.将Endotoxin Removal Beads充分混匀，用无热源枪头吸取适量浆液（以1ml为例）加入至层析柱中，打开下出口去掉保护液。用3ml的再生液清洗，控制流速在0.25ml/min，或每分钟小于10滴，温度控制在2-8℃。重复至少两次，确保柱子中无内毒素。
2.用3ml的平衡液平衡柱管内壁及层析介质，流干，流速约0.5ml/min，温度控制在2-8℃，重复至少两次。
3.将样品加到平衡好的Endotoxin Removal Beads中，调节流速在0.25ml/min，或每分钟小于10滴，当流出液流出约1ml时，开始收集流出液，流干后加入1ml平衡液继续收集。检测样品中内毒素含量及样品回收率。
4.如果样品中内毒素含量仍高于目标值，继续重复1-3。
3. 问题及解决方案
| 问题 |
原因分析 |
推荐解决方案 |
| 内毒素去除效率低 |
样品pH值不在内毒素结合范围内 |
用0.1MNaOH或0.1M HCl调节pH7-8 |
| 样品与层析介质接触时间短 |
减少流速，增加样品接触时间 |
| 去除或检测系统被内毒素污染 |
所有试验用品均需无热源产品 |
| 内毒素与目的蛋白结合较强 |
优化样品pH，使样品与内毒素分离；
增加接触时间 |
| 样品被污染 |
层析介质纯化过其他样品 |
不要用使用过的层析介质去除不同样品的内毒素 |
| 样品回收率低 |
样品非特异性吸附在层析介质上 |
增加样品和平衡液中的NaCl浓度 |
| 目的蛋白与内毒素结合一起被去除 |
优化样品pH，使样品与内毒素分离； |
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