1.产品介绍
Benzamidine Beads 4FF 是一种用于纯化胰蛋白酶、尿激酶和激肽释放酶等丝氨酸蛋白酶的介质。苯甲脒类物质是丝氨酸蛋白酶的广谱抑制剂，Benzamidine Beads 4FF 是将苯甲 脒类物质连接至高度交联的 4%琼脂糖介质上，可以从血清、细胞上清液和菌体裂解液中一 步纯化样品。具体性能见表 1。
表1. Benzamidine亲和层析介质(4FF)产品性能
| 性能 |
指标 |
| 基质 |
高度交联的4%琼脂糖微球 |
| 配体 |
4-氨基苯甲脒 |
| 载量（/ml 介质） |
>20mg/ml 介质 |
| 粒径 (μm) |
45-165 |
| 最大流速 |
0.3 MPa, 3 bar |
| pH 稳定范围 |
3-11 |
| 储存缓冲液 |
50mM NaAc，pH4.0，20%乙醇 |
| 储存温度 |
2-8℃ |
2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
-平衡/洗杂Buffer: 50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.4
-洗杂Buffer: 50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.4
-洗脱Buffer: 10mM HCl, 0.5M NaCl，pH2.0 或 50mM 甘氨酸，pH3.0
-中和Buffer：1M Tris,pH8.5
-竞争性洗脱Buffer：50mM Tris-HCl，20mM 4-氨基苯甲脒，0.5M NaCl，pH7.4
2.2 样品准备
样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
2.3 Benzamidine Beads 4FF 装填
Benzamidine Beads 4FF 被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装， 下面介绍使用Benzamidine Beads 4FF 填装层析柱的方法。
层析柱的装填（使用储液器装填）
-用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出 1-2cm的去离子水。
-将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
-如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
-打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的 75%） 当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。
-关闭泵，关闭层析柱出口。
-如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
-将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
-将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。
2.4 样品纯化
Benzamidine Beads 4FF 装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。
-将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
-用 3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。
-使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。
-利用泵或样品环上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
-用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
-使用 5-10 倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积 1/10 的中和液进行中和。
2.5 SDS-PAGE检测
将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
3. 层析介质清洗
本纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对树脂进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质，建议使用下面的方法
用2倍柱体积的 6M 盐酸胍或 8M 尿素溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的去离子水清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或2倍柱体积的 1% Triton™ X-100 清洗，然后立即用5 倍柱体积的去离子水清洗。
去除一些离子键结合物质
用 3-4 倍柱体积的 2M NaCl清洗，然后立即用5倍柱体积的去离子水清洗。
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