表1. Ni层析介质（NTA）产品性能

项目	性能
基质	4%琼脂糖凝胶
载量（/ml基质）	>40mg 6×His-tagged protein
微球粒径（μm）	45–165
最大压力	0.1 MPa, 1 bar
储存缓冲液	20% 乙醇1X PBS
工作温度	4°C-30°C

表2. Ni层析介质（NTA）可耐受试剂及浓度

试剂种类	浓度
还原剂	5 mM DTE 5 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione
变性剂	8 M urea 6 M Gua-HCl
去污剂	2% Triton™ X-100 (nonionic) 2% Tween™ 20 (nonionic) 2% NP-40 (nonionic) 2% cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic)
其他类	500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate

注：如果溶液中含有上述两种以上的试剂，介质的耐受性能可能会进一步下降。

2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
可使用下列推荐Buffer，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过滤除菌。因为Ni层析介质（NTA）可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白的纯化，两种方法所需Buffer不同，具体配置方法见表3，表4和表5。

表3. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

名称	体积	配方
Lysis Buffer	1L	50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 10 mM imidazole （0.68 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0， 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Wash Buffer	1L	50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 20 mM imidazole（1.36 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0， 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Elution Buffer	1L	50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 250 mM imidazole （17.0 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0， 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

表4. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方，pH洗脱方式

名称	体积	配方
Lysis Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea） 100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O） 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl） 使用盐酸溶液调节pH至8.0 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Wash Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea ） 100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O） 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl） 使用盐酸溶液调节pH至6.3 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Elution Buffer	1L	8 M Urea（480.50 g urea） 100 mM NaH2PO4（15.60 g NaH2PO4·2H2O） 100 mM Tris·HCl（15.76 g Tris·HCl） 使用盐酸溶液调节pH至4.5 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

表5. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方，咪唑洗脱方式

名称	体积	配方
Lysis Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea） 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 10 mM imidazole （0.68 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0， 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Wash Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea） 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 20 mM imidazole （1.36 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0， 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。
Elution Buffer	1L	8 M Urea （480.50 g urea） 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O） 300 mM NaCl （17.54 g NaCl） 250 mM imidazole （17.0 g imidazole） 使用NaOH溶液调节pH至8.0， 使用0.22 或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

2.2 样品准备
2.2.1 细菌或酵母表达可溶性蛋白 2.2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白 2.2.3包涵体蛋白纯化（变性条件） 2.3Ni NTA Beads 重力柱的装填
2.4样品纯化
2.4.1 孵育法纯化 2.4.2 重力柱法纯化 注：上述步骤介质洗脱结束后，先用Lysis buffer冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用20%的乙醇冲洗2个柱体积，然后将介质置于4度保存。

2.4 SDS-PAGE检测
3. 在位清洗
当层析介质使用过程中反压过高或层析介质上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗（Cleaning-in-Place, CIP）。
建议按照下面操作去除层析介质上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类 
通过使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20分钟可以去除此类污染物。然后，再使用10倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液，清洗层析介质2倍柱体积。例如，含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液，接触时间为1–2小时。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5个柱体积，以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱体积的去离子水清洗。
去除离子作用结合的蛋白 
使用1.5M NaCl溶液接触时间为10-15分钟清洗。然后，再使用去离子水清洗10个柱体积。

4. 层析介质再生
组氨酸标签蛋白亲和纯化层析介质所带的镍离子不需要经常螯合去除和重新挂镍离子。当层析介质使用过程中发现颜色变浅，或者层析介质载量明显变低时，需要进行对层析介质进行镍离子剥离和重新挂镍离子，也就是层析介质再生。将层析介质装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。 再生的层析介质，可以立即使用，如不立即使用，需将层析介质悬浮于等体积的20%的乙醇中，置于4-30°C保存。

5. 问题及解决方案
 

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	层析介质被堵塞	按照3.对层析介质的在位清洗。
		裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.2 or 0.45 μm）过滤，或者离心去除。
	样品太粘稠	样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg2+ （终浓度 1 mM），冰上孵育10-15分钟。
	缓冲液太粘稠	有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白	蛋白可能是包涵体，没有在上清中	可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。
	表达量太低	优化表达条件。
	目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤被洗下来了	提高wash Buffer的pH，或者降低咪唑浓度。
	目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来	降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑浓度。
		使用10-100mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到目的蛋白。
	蛋白降解	在4°C下进行纯化操作。
		菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。
洗脱组分不纯（含有多种蛋白）	洗杂不彻底	增加Wash Buffer体积。
	样品中含有其他的组氨酸标签蛋白	通过调节pH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。
层析介质颜色变浅或变成白色	镍离子脱落或被剥离	按照4.层析介质再生中的建议重新挂镍离子
层析介质呈现褐色	缓冲液中含有DTT等还原剂	适当降低还原剂DTT的浓度至2mM以下，或者改用巯基乙醇。
上样过程中蛋白发生沉淀	操作温度太高	4℃下进行上样。
	蛋白发生聚集	在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。