蛋白A层析介质 rProtein A Beads

货号: BDTL0001
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规格 价格 期货 数量
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产品基本信息

  • 产品货号 BDTL0001
  • 别名 蛋白A层析介质 rProtein A Beads
  • 产品名称 蛋白A层析介质 rProtein A Beads
  • 类别 纯化试剂
  • 性能 > 40mg human IgG
  • 粒径 45–165

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产品详情

1.    产品介绍
本品是用于分离和纯化单克隆抗体的通用性亲和层析介质,主要性能见下表。蛋白A  一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白,主要通过 Fc 片段结合哺乳动物 IgG ,但是不与  lgG 结合,不结合人 lgMlgD  IgA 。蛋白A 与蛋白G 与不同来源及亚类的免疫球蛋白 结合能力不一样(见附表) 。天然蛋白 A 有五个 IgG 结合区域和一些未知功能的区域,重 组蛋白A 去除了与白蛋白及细胞表面结合位点,只含有五个 IgG 结合区域,减少了非特异 性吸附。
蛋白A 层析介质性能表

 
指标 性能
基质 4%琼脂糖微球
配体 重组蛋白 A
载量 >40mg Rabbit lgG/ml 介质
粒径 (μm) 45-165
最大流速 0.1 MPa, 1 bar
pH  稳定范围 3-10
储存缓冲液 20%乙醇 1 ×PBS
储存温度 2-8

2.    纯化流程
2.1 Buffer 的准备
所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22μm   0.45 μm 滤膜过滤。
  结合/洗杂 Buffer0. 15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
  洗脱 Buffer0. 1M 甘氨酸,pH 3.0
  中和液:1M Tris-HCl pH8.5
1 / 5
 

2.2  样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和 pH 值,可以用结合/洗涤缓冲液对血清样 品、腹水或细胞培养液稀释,或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用 0.22μm   0.45μm 滤膜过滤,减少杂质,提高蛋白纯化效 率和防止堵塞柱子。
2.3  重力柱的装填
1.     取合适规格的重力层析柱,装入下垫片,加入适量纯水润洗柱管和垫片,关闭下出口。
2.      rprotein A Beads 混合均匀,用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占 悬液的一半) ,打开下出口流干保护液。
3.     加入适量纯水冲洗介质,待柱管中液体重力流干后,关闭下出口。
4.     装入润洗后的上垫片,确保垫片与介质之前没有空隙,且保持水平。
5.     装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡,暂不使用时则加入保护液,4℃保存。
2.4  样品纯化
2.4.1  孵育法纯化
  根据纯化的样品量,取适量 rProtein A Beads 加入离心管中,1000 rpm 离心 1 min ,吸弃 上清;也可加入重力柱中,流干保护液。
  向离心管中加入 5 倍介质体积的平衡液清洗介质,1000 rpm 离心 1 min ,吸弃上清;如 使用重力柱,则直接在重力柱中清洗,直接重力流干平衡液;重复两次以上。
  加入样品,封闭离心管或重力柱管,4  ℃振荡孵育 2-4 h 或者 37  ℃孵育 30 min-2h
  孵育结束后,1000 rpm 离心 1 min,吸弃上清,或过滤收集介质,上清保留作为流穿,用 于电泳鉴定。
   5 倍介质体积的洗杂液清洗介质,1000 rpm 离心 1 min 或重力柱管过滤,去除上清(注 意不要吸到介质),重复 3-5 次,中间建议更换新离心管。
  加入 3-5 倍柱体积的洗脱液进行洗脱,室温孵育 5min, 1000 rpm 离心 1 min 或重力柱管 收集洗脱液,可重复 2-3 次。洗脱组分需要立即调成中性,一般建议使用洗脱组分体积 1 / 10 的中和液进行中和。
2.4.2  重力柱法纯化
  将蛋白A 层析介质装入合适的层析柱,层析用 5 倍柱体积的平衡 Buffer 进行平衡,使 介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,重复 2-3 次,起到保护蛋白的作用。
  将样品加到平衡好的层析介质中样品保留时间至少 2 min,保证样品和介质充分接触,收 集流出液,可以反复上样增加结合效率(保证目的蛋白与层析介质充分接触,提高目的 蛋白的回收率。
   10-15 倍柱体积的洗杂 Buffer 进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液。
  使用 5-10 倍柱体积的洗脱Buffer ,分段收集,每一个柱体积收集一管,分别检测,既

2 / 5
 
可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱,又可以得到高纯度和高浓度的蛋白。洗脱组分需 要立即调成中性,一般建议使用洗脱组分体积 1 / 10 的中和液进行中和。
注:上述步骤介质洗脱结束后,依次使用3 倍柱体积的结合 Buffer 5 倍柱体积的去离子 水平衡介质,最后再用20%的乙醇冲洗 2 个柱体积,然后将介质置于 4 度保存。

2.5 SDS-PAGE 检测
将使用纯化产品得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分)以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。
3.  层析介质清洗
本品可以重复使用而无需再生,但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集,往往造成流 速和结合载量都下降,严重影响柱子的性能,这时需要对层析介质进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质
 2 倍柱体积的6M 盐酸胍溶液进行清洗,然后立即用5 倍柱体积 PBS, pH 7.4 清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
 3-4 倍柱体积的 70%乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗,然后立即用 5 倍柱体 积的 PBS pH 7.4 清洗。

4.    问题及解决方案

 
问题 原因分析 推荐解决方案


柱子反压过高
筛板被堵塞 清洗或更换筛板

层析介质被堵塞
按照第3部分进行层析介质清洗
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议过滤
样品纯化过程中曲 线不稳
样品或buffer 中有气泡
去除样品或柱子中的气泡
样品和buffer进行脱气
洗脱组分中没有  的蛋白 样品中抗体浓度太低 使用其抗原做配体的介质
抗体被降解 适当的提高洗脱pH

回收率逐渐减低
上样量太多 减少上样量
柱子太脏,载量降低 按照第3部分进行层析介质清洗





3 / 5
 
5.  抗体纯化介质一览表
 


蛋白A 层析介质
(普通型、高载量、特异性优良)
BDTL0001-1 1ml
BDTL0001-5 5ml
BDTL0001-25 25ml
BDTL0001-100 100ml
蛋白A 重力预装柱套装 BDTL0001-K

蛋白A 高速层析介质(4FF
(高流速、高载量、特异性优良、耐压)
BDTL0002-5 5ml
BDTL0002-25 25ml
BDTL0002-100 100ml


蛋白A 高速层析介质(4FF)预装柱
(预装柱、高流速、高载量、配套 BioRad GE 等公司机器)
BDTL0002-11 1×1ml
BDTL0002-51 5×1ml
BDTL0002-15 1×5ml
BDTL0002-55 5×5ml
BDTL0002-3115 3×1ml+1×5ml


蛋白G 层析介质
(普通型、高载量、特异性优良)
BDTL0003-1 1ml
BDTL0003-5 5ml
BDTL0003-25 25ml
BDTL0003-100 100ml
蛋白G 重力预装柱套装 BDTL0003-K

蛋白G 高速层析介质(4FF
(高流速、高载量、特异性优良、耐压)
BDTL0004-5 5ml
BDTL0004-25 25ml
BDTL0004-100 100ml


蛋白G 高速层析介质(4FF)预装柱
(预装柱、高流速、高载量、配套 BioRad GE 等公司机器)
BDTL0004-11 1×1ml
BDTL0004-51 5×1ml
BDTL0004-15 1×5ml
BDTL0004-55 5×5ml
BDTL0004-3115 3×1ml+1×5ml

附表  Protein A  Protein G 对不同抗体的结合能力
 
种属 亚型 Protein A  结合力 Protein G  结合力

Human
IgA Variable -
IgD - -
4 / 5

  IgE - -
IgG1 ++++ ++++
IgG2 ++++ ++++
IgG3 - ++++
IgG4 ++++ ++++
IgM Variable -
Avian egg yolk IgY - -
Cow   ++ ++++
Dog   ++ +
Goat   - ++
Guinea pig IgG1 ++++ ++
IgG2 ++++ ++
Hamster   + ++
Horse Total IgG ++ ++++
Koala   - +
Liama   - +
Monkey (rhesus)   ++++ ++++



Mouse
IgG1 + ++++
IgG2a ++++ ++++
IgG2b +++ +++
IgG3 ++ +++
IgM Variable -
Pig   +++ +++
Rabbit Total IgG ++++ +++


Rat
IgG1 - +
IgG2a - ++++
IgG2b - ++
IgG3 + ++
Sheep Total IgG +/- ++
++++:结合能力强; ++:结合能力中等;- :结合能力弱或没有结合
 

文献引用 (1)

Q1: 本产品可以重复使用几次?蛋白的回收率有多少?

Q2: 3ml的重力预装柱套装一次性最多能加多少样品

Q3: 填料离心力是多少

Q4: 我的纯化没富集到抗体,流穿和洗洗杂、洗脱液,可以再拿去过一遍柱子吗?

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