MYC标签亲和层析介质 Anti-c-Myc Affinity Beads

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货号: BDTL0071

规格	价格	货期	数量

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产品基本信息

产品货号 BDTL0071
产品名称 MYC标签亲和层析介质 Anti-c-Myc Affinity Beads
类别蛋白表达
粒径 45-165
用途 MyC抗体标签亲和填料

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产品详情

1.产品介绍

Anti-c-Myc Affinity Beads 可以检测原核、真核表达的 c-Myc 标签融合蛋白。c-Myc 多肽是由人类染色体 8q24 上的c-Myc 基因编码，对应于人类 P62 的 410-419（EQKLISEEDL）氨基酸。Anti-c-Myc Affinity Beads 可以识别 C 端，N 端或内部 c-Myc 标签蛋白融合蛋白，可应用在 Western-blot 杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。
表1. Anti-c-Myc Affinity Beads产品性能

项目	性能
基质	4%琼脂糖微球
配体	Anti-c-Myc 人单克隆抗体
结合能力	≈1 mg c-Myc 标签蛋白/ml 介质
粒径 (μm)	45-165
最大流速	0.1 MPa, 1 bar
储存缓冲液	1× PBS（含防腐剂）
储存温度	2-8℃

2. 纯化流程
2.1 Buffer的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。

平衡/洗杂 Buffer: 50mM Tris，0.15M NaCl, pH 7.4
酸性洗脱Buffer: 0.1 M glycine HCI, pH3.0
竞争性洗脱Buffer: 50 mM Tris，0.15 M NaCl，100-500 μg c-Myc 多肽/ml，pH 7.4
中和液：1M Tris-HCl, pH8.0

2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3 样品纯化
3.1柱层析

将Anti-c-Myc Affinity Beads 装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。
将样品加到平衡好的Anti-c-Myc Affinity Beads中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。
用10-20倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
酸性洗脱：使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱，收集管中预先加好中和液，加入量10-20μl中和液/ml洗脱液，分管收集。

注：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-c-Myc Affinity Beads 在洗脱液中不要超过20 min。
竞争性洗脱：使用 5 倍柱体积的竞争性洗脱液洗脱。分管收集。

使用3倍柱体积的洗脱液清洗，然后用平衡液平衡至中性。
然后保存在PBS溶液（含防腐剂）中，2-8℃保存。

3.2静态吸附

填料准备：取适量的Anti-c-Myc Affinity Beads加入层析柱中，流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。
加入样品溶液，4°C或室温震荡孵育至少30 min（不能磁力搅拌），确保填料与样品溶液充分混合。
孵育完毕后，将填料混合液离心（5000×g离心1 min）或过滤收集填料。
将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。
用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱，参考3.1中4。
填料再生和保存参考3.1中5.和6.。

3.3免疫沉淀操作流程

填料准备：取40μl的Anti-c-Myc Affinity Beads（柱体积20μl）混合液加入到1.5ml离心管中，5000×g离心1min,吸弃上清。
填料加入0.5ml平衡液，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用），5000×g离心1min,吸弃上清。重复一次。
加入200-1000μl样品裂解液或细胞提取物到处理好的填料中，混合均匀，在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸附，室温至少1小时。5000×g离心1min,吸弃上清，小心不要吸走填料。
洗杂：加入0.5ml的洗杂液，悬浮填料，轻轻混匀，5000×g离心1min,吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。
样品洗脱：可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。

A：酸性洗脱
加入100μl的酸性洗脱液，悬浮填料，室温孵育5min。 5000×g离心1min。小心取出上清，不要吸到填料，用中和液中和。洗脱样品放置4°C,长时间放置-20°C保存。
B：竞争性洗脱
加入100μl的竞争性洗脱液洗脱，室温孵育30min。 5000×g离心1min。小心取出上清，不要吸到填料。洗脱样品放置4°C,长时间放置-20°C保存。
C：变性洗脱
实验室常规蛋白上样缓冲液（Loading Buffer）中含有β-巯基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使Anti-c-Myc抗体变性，洗脱后的Anti-c-Myc Affinity Beads没办法重复使用。
每管中加入20μl 2× Loading Buffer, 95°C加热5min。 5000×g离心1min,吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测。

4. 问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
流穿中有目的蛋白	填料过载	减少上样体积或增加填料体积。
	结合时间太短	延长样品和填料的结合时间。可过夜孵育。
	标签未暴露	可以加入低浓度的变性剂，上样前透析。
	溶液中试剂不兼容	样品上样前进行透析。
洗脱组分中没有目的蛋白	目的蛋白不稳定	使用新配制的样品。低温操作。细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂。
	样品中无标签融合蛋白	纯化前Western检测是否有c-Myc标签蛋白
	目的蛋白表达量太低	优化蛋白表达量。增加上样量，减少NaCI浓度。
背景太高	非特异性吸附	最后一次洗杂后，填料转到新的管子里再洗脱或IP。
背景太高	洗杂不充分	增加洗杂次数，每次清洗孵育5-10 min。增加洗杂液中盐离子浓度。

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Q1: MYC标签亲和层析介质用来做CO-IP能重复利用几次？有相关数据吗

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